實(shí)驗(yàn)方法原理

       HL-60細(xì)胞是一種急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，在體外無需加刺激因子，可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，經(jīng)二甲基亞砜處理后的HL-60細(xì)胞按粒系途徑定向成熟分化，同時(shí)細(xì)胞的增殖力降低，幾乎全部細(xì)胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。因此，這種方法可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。

 

       實(shí)驗(yàn)材料        HL-60細(xì)胞

       試劑、試劑盒        小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、臺(tái)盼蘭、瓊脂、二甲基亞砜

       儀器、耗材        超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、顯微鏡、培養(yǎng)瓶、吸管、酒精燈、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、多孔培養(yǎng)板

 

       實(shí)驗(yàn)步驟        

       1.  收集對(duì)數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，先按實(shí)驗(yàn)十三測定細(xì)胞活力，然后調(diào)整細(xì)胞濃度，制成300~1 000活細(xì)胞/ml 的細(xì)胞懸液。

       2.  取二個(gè)培養(yǎng)瓶每個(gè)瓶中加9 ml 調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，然后各加入1 ml 3%瓊脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混勻。

       3.  用微量加樣器吸140 μl 二甲基亞砜（MDSO），加到一個(gè)瓶中，充分混勻，為實(shí)驗(yàn)組，另一瓶不加DMSO，為空白對(duì)照組。

       4.  取一個(gè)16 mm 多孔培養(yǎng)板，每孔加1 ml（35 mm 培養(yǎng)皿需加2 ml）細(xì)胞瓊脂懸液，勿有氣泡，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分兩組加好，蓋上蓋并作好標(biāo)記。

       5.  在室溫放置20分鐘使細(xì)胞瓊脂懸液凝固。

       6.  然后移培養(yǎng)板或平皿于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

       7.  培養(yǎng)7~10天，肉眼觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。

       8.  結(jié)果：以肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)（含500個(gè)以上細(xì)胞）作為計(jì)數(shù)集落的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組HL-60細(xì)胞在含0.3%的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，每個(gè)孔中可見有多個(gè)集落形成，而實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞因經(jīng)二甲基亞砜誘導(dǎo)分化，細(xì)胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。

       9.  集落的計(jì)數(shù)和計(jì)算：

       （1）集落數(shù)=n孔中細(xì)胞集落數(shù)總和/n孔

       （2）集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)×100%